原代肝細胞—藥物研發(fā)“CP"

—重點(diǎn)問(wèn)題解答—

第一題    貼壁和懸浮肝細胞使用的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？在具體實(shí)驗過(guò)程中應該如何選擇呢？

答：肝細胞被分離后，可進(jìn)行懸浮培養或貼壁培養。懸浮培養的原代肝細胞在最開(kāi)始的4~6h內細胞色素P450酶的活性最為和體內一致，隨時(shí)間的延長(cháng)而迅速下降，故懸浮肝細胞一般用于代謝穩定性研究或代謝物譜研究。貼壁培養的原代肝細胞有足夠的時(shí)間從損傷中恢復過(guò)來(lái)，保持了正常肝細胞的生物學(xué)特征及代謝活性，一般用于酶誘導研究、藥物細胞毒性研究、慢代謝藥物的代謝穩定性或產(chǎn)物推斷研究。

第二題    貼壁原代肝細胞復蘇之后可以存活多久，如果肝細胞復蘇后不做貼壁培養可以維持多久？

答：

（1）貼壁原代肝細胞一般用于酶誘導實(shí)驗，細胞復蘇后使用鋪板培養基懸浮，調整細胞至適宜濃度后使用膠原包被板進(jìn)行培養，一般在4~6小時(shí)內細胞可進(jìn)行貼壁。細胞貼壁后，更換維持培養基繼續維持18h，以保證細胞狀態(tài)能最大可能恢復。接下來(lái)，即可開(kāi)展酶誘導實(shí)驗，并進(jìn)行代謝活性和mRNA誘導水平的檢測。從整個(gè)周期來(lái)看，肝細胞貼壁后可以維持6~7天狀態(tài)，且隨時(shí)間延長(cháng)細胞貼壁狀態(tài)變差，細胞會(huì )出現脫落懸浮現象。

（2）如果貼壁肝細胞不進(jìn)行貼壁培養，我們驗證過(guò)在4~6小時(shí)內是可以維持在較好的狀態(tài)，更長(cháng)時(shí)間的驗證我們還暫時(shí)未開(kāi)展。

第三題    關(guān)于貼壁肝細胞，會(huì )進(jìn)行哪些酶的誘導實(shí)驗？誘導效果如何？

答：我們的原代肝細胞均會(huì )使用指導原則推薦的陽(yáng)性誘導劑對CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4三種酶的誘導效果進(jìn)行評估，且酶誘導結果符合要求才會(huì )進(jìn)行銷(xiāo)售?！端幬锵嗷プ饔弥笇г瓌t》明確規定研究在研藥物是否為代謝酶的誘導劑應評估其是否會(huì )誘導主要的 CYP 同工酶 CYP1A2、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 或 CYP3A4。研究初期， 可只評估 CYP1A2，CYP2B6 和 CYP3A4。

第四題    酶誘導實(shí)驗為什么選擇三個(gè)供體肝細胞？

答：根據《藥物相互作用指導原則》介紹，至少采用三個(gè)供體，每個(gè)供體的誘導結果應單獨評估。如果至少一個(gè)供體的結果超過(guò)了預定的閾值，則在研藥物可能具有誘導作用，需進(jìn)行后續評估。

第五題    酶誘導實(shí)驗中，若其中一個(gè)供體有1A2的誘導作用，其他兩個(gè)供體沒(méi)有，需要重復驗證，需要怎么驗證？

答：如需進(jìn)行重復驗證，可以通過(guò)增加供體數、重復實(shí)驗等多種方法對實(shí)驗結果進(jìn)行確證。評估在研藥物對代謝酶潛在誘導作用的方法主要有以下三種：倍數變化方法、相關(guān)性方法、基礎動(dòng)力學(xué)模型等，具體可參考《藥物相互作用指導原則》。

第六題    為什么只關(guān)注 CYP酶的誘導，而不關(guān)注二相酶如UGT的誘導？

答：只關(guān)注CYP酶的誘導是因為對CYP酶的誘導機制已經(jīng)研究的較為清楚，而沒(méi)有要求對UGT酶的誘導進(jìn)行研究是由于目前對其機制還不是很清楚，并不是說(shuō)它不會(huì )被誘導。指導原則中也有說(shuō)到，對于轉運體以及 II 相代謝酶的誘導劑或者抑制劑還沒(méi)有標準化的分類(lèi)系統。

第七題    3個(gè)供體是不是相當于做重復實(shí)驗，為了數據統計有意義？

答：選擇三個(gè)供體進(jìn)行實(shí)驗，除了使結果具有統計學(xué)意義外，更重要的也是為了評估個(gè)體間的差異，如果至少一個(gè)供體的結果超過(guò)了預定的閾值，則在研藥物可能具有誘導作用，需進(jìn)行后續評估。

第八題    酶誘導實(shí)驗中進(jìn)行細胞活性測定選什么方法合適？中性紅法會(huì )不會(huì )影響到后續的反轉錄過(guò)程？

答：為保證酶活性檢測不會(huì )影響到后續的反轉錄過(guò)程，通常在檢測方法和試劑的選擇上需要非常謹慎，通常大家都會(huì )選擇CCK-8或cell-Titer進(jìn)行細胞活性檢測。目前，也有關(guān)于使用中性紅染料對肝細胞進(jìn)行活率檢測的報導，具體可參照下文。

第九題    酶誘導實(shí)驗使用的原代肝細胞需使用哪些試劑和耗材？

答：酶誘導實(shí)驗需要用到膠原包被板和四種配套的培養基，分別為：復蘇培養基，用于細胞復蘇過(guò)程；貼壁培養基，用于肝細胞初始貼壁；維持培養基，用于細胞狀態(tài)的恢復和后續誘導；孵育培養基，用于誘導后酶活性的測定。

第十題    酶誘導實(shí)驗的過(guò)程是什么？可使用同一塊板嗎？

答：體外肝細胞誘導實(shí)驗基本流程：

①使用復蘇培養基進(jìn)行細胞復蘇；

②使用鋪板培養基基將細胞進(jìn)行懸浮調整細胞密度后進(jìn)行細胞鋪板（膠原包被板）；

③鋪板4-6小時(shí)后細胞貼壁，更換維持培養基進(jìn)行換液維持18小時(shí)。

④維持后細胞恢復最好狀態(tài)開(kāi)始誘導實(shí)驗，一般周期為2~3天。

⑤誘導結束后使用孵育培養進(jìn)行藥物代謝測定。另外，測定藥物誘導活性、活力測定、mRNA表達水平等測定使用同一塊板。需要注意的是，肝細胞貼壁培養要使用推薦的培養基，如使用維持培養基進(jìn)行細胞貼壁，維持培養基內營(yíng)養成分不足以維持細胞貼壁所需營(yíng)養，則達不到預期實(shí)驗結果。

十一題    懸浮原代肝細胞可以培養多久？有沒(méi)有測試過(guò)其它Buffer的維持效果，如HBSS？

答：懸浮原代肝細胞復蘇后，我們會(huì )使用自研的孵育培養基進(jìn)行細胞維持，一般情況細胞可懸浮維持4-6小時(shí)，且隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)細胞會(huì )逐漸死亡。目前，我們還未測試過(guò)其它Buffer對細胞的維持效果，如HBSS。

十二題    藥物體外研究中最常使用的系統是肝微粒體，肝微粒體也包含了藥物代謝相關(guān)的主要CYP酶、UGT酶等，那么為什么還要選擇肝細胞呢？

答：微粒體在常規藥物代謝研究中應用廣泛，如代謝途徑研究，酶抑制研究等，但是與原代肝細胞相比，微粒體卻有其自身劣勢：

（1）微粒體內所含酶直接暴露，藥物或其代謝產(chǎn)物與代謝酶之間有現成的反應通路，而不能反映體內的情況，而且微粒體需要輔助因子參與才可進(jìn)行藥物代謝反應；

（2）肝細胞胞質(zhì)中還存在部分肝微粒體缺失的代謝酶，如醛氧化酶（AO）、黃嘌ling氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）等；

（3）微粒體中富含細胞色素P450酶和UGT酶，因此與其他酶之間不存在競爭性，這會(huì )導致藥物在微粒體中比在完整的細胞體系內表現出更高的生物轉化率。然而，原代肝細胞卻體現出了其優(yōu)勢，例如藥物擴散、轉運、代謝的過(guò)程是基于整體細胞水平的，而且原代肝細胞培養后可維持數天的活性，這提高了評價(jià)藥物代謝酶上調或下調的可行性等。

十三題    在肝細胞代謝穩定性實(shí)驗中陽(yáng)性化合物質(zhì)控的標準是多少呢？

答：目前，還沒(méi)有明確的文件規定陽(yáng)性化合物半衰期和清除率的接受范圍，并且每個(gè)公司選擇的陽(yáng)性化合物也可能不同，大家可分析自己公司的歷史數據，形成自己內部的接受標準。本公司原代肝細胞產(chǎn)品也會(huì )選擇大家使用頻率最高的陽(yáng)性化合物，對其半衰期和清除率進(jìn)行測定，并將其展現在我們的產(chǎn)品COA中，供大家挑選。

十四題    本公司能否提供除猴、犬、大鼠、小鼠等常見(jiàn)種屬之外的其它種屬肝細胞定制服務(wù)？

答：除常規種屬的原代肝細胞外，本公司還可提供特定種屬、特定周齡等的定制服務(wù)，具體可聯(lián)系商務(wù)團隊，我們也會(huì )根據您的實(shí)驗需求推薦最適肝細胞選擇。

十五題    是不是因為使用的培養基的不同，肝細胞既能當作懸浮細胞使用，又能當成貼壁細胞使用呢？

答：大部分來(lái)自實(shí)體組織器官的細胞都會(huì )貼壁，但不是所有的細胞在體外培養的情況下都會(huì )貼壁。細胞貼壁與否首先會(huì )與細胞本身狀態(tài)有關(guān)；同時(shí)貼壁細胞也需要特定培養基及一些特殊的促細胞附著(zhù)物質(zhì)（如鼠尾膠原、如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、血清擴展因子等）可能參加細胞的貼附過(guò)程）等。也就是說(shuō)，貼壁細胞我們可以作為懸浮細胞使用，但懸浮細胞不一定可用于貼壁使用。

十六題    代謝穩定性研究中微粒體和肝細胞該如何選擇？是不是只需要選擇其中一個(gè)就可滿(mǎn)足要求？

答：在代謝穩定性研究中，選肝微粒體還是選肝細胞，主要還是要看化合物的代謝特性，誰(shuí)代謝速率高選誰(shuí)。一般情況下，優(yōu)先選用肝微粒體，尤其是在化合物分子水溶性較強、一相代謝為主要代謝途徑（尤其是經(jīng)由CYP）等情況下，肝微粒體為第一選擇。當有證據顯示二相代謝為主要途徑、水解作用為主要代謝途徑、肝微粒體中非特異性蛋白結合很高、肝微粒體中代謝不明顯的時(shí)候，可使用肝細胞進(jìn)行實(shí)驗。通常情況下，選擇一個(gè)代謝系統即可滿(mǎn)足需求，若各方面條件允許，兩個(gè)系統同時(shí)選擇肯定是很好的。

十七題    有機溶劑的加入對肝細胞有什么影響？

答：孵育體系中有機溶劑的含量要控制在1%以?xún)?。孵育體系中發(fā)揮代謝作用的組分是酶，而酶的本質(zhì)是蛋白，有機溶劑加入過(guò)多，會(huì )導致酶變性，活性降低或喪失，故孵育體系中要控制有機溶劑的加入量。

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